Étude de l’effet de mutations du domaine 3’-PPT du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) sur la sensibilité au facteur de restriction APOBEC3G


Responsable de l’encadrement : RICHETTA Clémence
Tél : 01 81 87 52 17  E-mail: clemence.richetta@ens-paris-saclay.fr

UMR CNRS 8113, ENS-Paris-Saclay

Résumé du Projet de Stage

Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH-1) est un lentivirus dont le cycle de réplication est caractérisé par une étape de transcription inverse (RT) du génome ARN viral en ADN viral linéaire qui s’intègre ensuite dans le génome cellulaire. L’intégration constitue une étape essentielle puisqu’elle assure la stabilité du provirus à l’origine de la production de nouvelles particules virales infectieuses.
Nos récents travaux ont permis d’isoler un virus mutant du VIH-1 utilisant un mécanisme de réplication inédit indépendant de la voie classique d’intégration (Richetta et al, 2022). Le virus sélectionné possède des mutations au niveau de la région « polypurine tract » située en 3’ (3’-PPT) impliquée dans l’étape de RT. Au cours de la réplication virale, les mutations de la région 3’-PPT entrainent une modification du processus de RT conduisant à la formation d’ADN viral circulaire non intégré (cercles à 1-LTR) au lieu de la formation classique d’ADN viral linéaire (substrat de l’intégrase). Les cercles à 1-LTR ainsi formés permettent l’expression de protéines virales et la formation de nouvelles particules virales infectieuses rendant la réplication du virus indépendante de la voie intégrative. Des mutations similaires de la région 3′-PPT ont été identifiées chez des patients infectés par le VIH-1 en échec thérapeutique suggérant que l’acquisition de telles mutations modifiant drastiquement le mécanisme de RT constitue une voie d’échappement aux antirétroviraux notamment aux inhibiteurs de l’intégrase.
La RT est une des différentes étapes du cycle du VIH-1 ciblées par les facteurs de restriction cellulaires. En effet, la protéine APOBEC3G (A3G), encapsidée dans les particules virales en formation, est une cytidine déaminase qui introduit des mutations dans l’ADN synthétisé au cours de la RT, ce qui est délétère pour la réplication virale. Il a été montré que la présence d’une deuxième région PPT (PPT central) chez le VIH-1 permet de limiter l’effet d’A3G en diminuant l’exposition de l’ADN simple brin (-) en formation. Puisque le virus mutant 3’-PPT que nous avons identifié possède un domaine 3’-PPT destructuré entrainant un changement du processus de RT, ce mutant pourrait présenter une sensibilité accrue à A3G. En ce sens, nos données préliminaires suggèrent que la réplication du virus mutant 3’-PPT est fortement impactée par la présence d’A3G. L’objectif de ce projet de M2R sera de mieux caractériser l’influence d’A3G sur la réplication du mutant 3’-PPT.
Pour cela, des méthodes classiques de virologie et de biologie cellulaire seront utilisées. Différents virus (WT et mutant du 3’-PPT) seront produits en absence ou en présence d’A3G et seront utilisées pour infecter des lignées cellulaires ou des lymphocytes T CD4 primaires issues de sang obtenu auprès de l’Établissement Français du Sang (EFS). Si un effet d’A3G est observé, nous vérifierons qu’il est bien dû à l’activité cytidine deaminase en produisant des virus en présence de protéines A3G mutées au niveau de leur site catalytique. Nos données préliminaires montrent que le virus 3’-PPT mutant ne se réplique pas dans les LT CD4+ primaires probablement à cause de l’expression d’A3G dans ces cellules. Afin de vérifier cette hypothèse, l’expression d’A3G sera modulée dans ces cellules par l’utilisation de shRNA. La réplication virale sera analysée par différentes techniques incluant notamment la cytométrie en flux et la PCR quantitative en temps réel. Ce projet pourra se poursuivre par une thèse. Grâce à nos collaborations avec des cliniciens de l’Hôpital Bichat et de la Pitié-Salpêtrière, l’objectif à plus long terme de cette étude est d’analyser l’influence d’A3G sur l’émergence de virus possédant des mutations au niveau du domaine 3′-PPT dans des cellules issues de patients résistants aux inhibiteurs de l’intégrase. Ainsi, ce projet de M2R permettra à l’étudiant de maitriser un large panel de méthodes allant de la biologie moléculaire et cellulaire à l’échelle clinique.

Dernières Publications en lien avec le projet :

• Richetta, C.; Tu, N. Q.; Delelis, O. Different Pathways Conferring Integrase Strand-Transfer Inhibitors Resistance. Viruses 2022, 14 (12), 2591. https://doi.org/10.3390/v14122591.

• Richetta, C.; Subra, F.; Malet, I.; Leh, H.; Charpentier, C.; Corona, A.; Collin, G.; Descamps, D.; Deprez, E.; Parissi, V.; Calvez, V.; Tramontano, E.; Marcelin, A.-G.; Delelis, O. Mutations in the 3’-PPT Lead to HIV-1 Replication without Integration. J Virol 2022, 96 (14), e0067622. https://doi.org/10.1128/jvi.00676-22.
• Richetta, C.; Thierry, S.; Thierry, E.; Lesbats, P.; Lapaillerie, D.; Munir, S.; Subra, F.; Leh, H.; Deprez, E.; Parissi, V.; Delelis, O. Two-Long Terminal Repeat (LTR) DNA Circles Are a Substrate for HIV-1 Integrase. J Biol Chem 2019, 294 (20), 8286–8295. https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.006755.
• Bergantz, L.; Subra, F.; Deprez, E.; Delelis, O.; Richetta, C. Interplay between Intrinsic and Innate Immunity during HIV Infection. Cells 2019, 8 (8), 922. https://doi.org/10.3390/cells8080922.
• Malet, I.; Subra, F.; Richetta, C.; Charpentier, C.; Collin, G.; Descamps, D.; Calvez, V.; Marcelin, A.- G.; Delelis, O. Reply to Das and Berkhout, “How Polypurine Tract Changes in the HIV-1 RNA Genome Can Cause Resistance against the Integrase Inhibitor Dolutegravir.” mBio 2018, 9 (3), e00623-18. https://doi.org/10.1128/mBio.00623-18.

 Ce projet s’inscrit dans la perspective d’une thèse

 Ecole Doctorale de rattachement : ED Structure et dynamique des systèmes vivants
(SDSV)

                                       

Laboratoire d’accueil :

Equipe d’Accueil : Virologie Fondamentale et Pharmacologie des Pathologies Infectieuses
Intitulé de l’Unité : Laboratoire de Biologie et Pharmacologie Appliquée UMR CNRS 8113, ENS-Paris-Saclay
Nom du Responsable de l’Unité : DEPREZ Eric
Nom du Responsable de l’Équipe : DELELIS Olivier
Adresse : 4 avenue des Sciences, 91 190 Gif-sur-Yvette